Continuación

A medida que el CP penetra en el embrión, éste se expande gradualmente a causa de una re-entrada de agua para el mantenimiento del equilibrio osmótico. El momento en que se produce esta re-expansión refleja:

• La especie del embrión.

• El estadio de desarrollo embrionario.

• El ratio superficie/volumen del embrión.

• El crioprotector utilizado.

• La temperatura de exposición.

Dentro de los sistemas de equilibrio (inicialmente diseñados para la congelación de embriones in vivo), la técnica más utilizada en el caso de los EPIV es la congelación en EG 1,5M en presencia de sacarosa. El equilibrio se alcanza a -7ºC (Tª de seeding) para después, realizar un descenso de la temperatura hasta los -32ºC a una velocidad de 0,3ºC/min.

Técnicas actuales de congelación de embriones in vitro

Congelación tradicional (métodos de equilibrio)

Los crioprotectores (CP) utilizados en estos métodos son normalmente permeables. Los más frecuentemente utilizados son: glicerol y etilenglicol.

Durante la fase inicial de preenfriamiento, los embriones se exponen a la presencia del crioprotector en una fase que denominamos de equilibración. La respuesta inmediata del embrión ante la presencia de un CP permeable es una rápida disminución de volumen por pérdida del agua intracelular, hasta que se alcanza el equilibrio. Este fenómeno se debe a la hiperosmolaridad inicial de la solucion extracelular y a que los embriones son mucho más permeables al agua que a los crioprotectores; la contracción se detiene cuando se alcanza el equilibrio entre la salida de agua y la entrada del CP. 

Las microgotas citoplasmáticas

Las microgotas citoplasmáticas de lípidos tienen una fuerte relación espacial con el retículo endoplásmico liso y desempeñan un papel muy importante como fuente de elementos nutritivos, pero también modificando las propiedades físicas y las funciones de las membranas. La presencia de estas microgotas podría tener, por si misma, un efecto directo sobre la supervivencia durante el enfriamiento.

El metabolismo embrionario

El metabolismo embrionario ha sido y es objeto de una gran cantidad de estudios, orientados a la elaboración de medios de cultivo que aporten al embrión todos aquellos sustratos necesarios para su adecuado desarrollo y no otros; el último fin sería la optimización de las técnicas de cultivo in vitro. Otra parte de los estudios está destinada a una profundización en el conocimiento de las diferencias entre ambos tipos de embriones, con el fin de poder responder a interrogantes como la diferente sensibilidad a la crioconservación.

La estructura mitocondrial

La estructura mitocondrial también difiere entre ambos tipos de embriones. Los EPIV ven reducida de forma significativa la relación volumen mitocondrial/volumen citoplasmático con relación a los embriones in vivo (9). Si tenemos en cuenta que este orgánulo es el lugar de la célula donde se asienta la mayor parte de las reacciones oxidativas responsables del suministro de energía y de los procesos de síntesis de ATP acoplados a dichas reacciones, cabe pensar que este hecho diferencial tenga también un reflejo a nivel metabólico.

Ultraestructura

La microscopía electrónica

La microscopía electrónica permite la observación de diferencias entre los embriones producidos in vivo en in vitro, en idénticos estadios de desarrollo, y entre EPIV en función del medio de cultivo. Los blastómeros de los EPIV tienen un número más elevado de vacuolas citoplasmáticas y fagosomas. Las uniones "gap" entre células son más cortas y menos numerosas. De una forma general, los embriones cultivados in vitro tienen un aspecto más oscuro y el citoplasma está sembrado de gran cantidad de inclusiones lipídicas, cuyo número varía en función de las condiciones de cultivo. Estas son muy numerosas cuando se suplementa el medio con suero, y son menos abundantes en el citoplasma de embriones cultivados en medios suplementados únicamente con BSA y aminoácidos.

Aberraciones Cromosómicas

La frecuencia de aberraciones cromosómicas varía entre un 2-17% en los embriones in vivo, para elevarse hasta un 45% en el caso de los EPIV, según el estadio de desarrollo; los factores que favorecen la aparición de estas alteraciones pueden tener un origen intrínseco (edad materna, calidad del ovocito...), pero principalmente tienen un origen extrínseco en el caso de la manipulación in vitro. En los bovinos las anomalías cromosómicas serían las responsables de parte de las mortalidades embrionarias precoces observadas en el momento de la implantación entre los días 21 y 35 tras la transferencia de EPIV. De hecho, las tasas de gestación medidas a día 21 por los niveles séricos de proteína específica de gestación, suelen ser más elevadas, para experimentar un descenso después del día 35.

Técnicas de coloración diferencial

Las técnicas de coloración diferencial existentes hoy en día permiten evidenciar más diferencias entre los embriones in vivo y los EPIV. Aunque embriones en el mismo estadio de desarrollo tengan un número comparable de células totales, la cantidad de células de la MCI es significativamente inferior en el caso de los EPIV (35). La evaluación conjunta del número total de células y del de la MCI es otro buen indicador de la calidad del embrión desarrollado en un sistema de producción determinado.

Ricardo Fernández barrueco

Evaluación del número de células

La evaluación del número de células de los embriones bovinos obtenidos in vivo, es otro indicador de su viabilidad embrionaria. El número de células de los EPIV es variable en función de los diferentes sistemas de cultivo empleados, pero también del sistema de recuento que puede dar lugar a amplios errores. 

Los blastocistos cocultivados con células del cúmulus en medio M199, tienen la mitad de células que los cultivados en un oviducto de coneja como hospedadora intermediaria. Por su parte, los embriones desarrollados en medio condicionado por células de oviducto, tienen un número de células significativamente menor que los embriones desarrollados en sistemas de cocultivo.

La viabilidad de los embriones cultivados

Embriones cultivados

La viabilidad de los embriones cultivados in vitro tras crioconservación está correlacionada con su cinética de desarrollo. Efectivamente, aquellos embriones que sufren su primera segmentación 26 a 36 h postFIV, alcanzan el estado blastocisto más rápidamente que los que se segmentan de forma más tardía (36-48 h). Estos blastocistos desarrollados tras 6-7 días de cultivo in vitro son menos sensibles a la congelación que los que necesitan ser cultivados durante más tiempo para alcanzar dicho estadio.

Divición asincrónica de los EPIV

Es más, los EPIV se dividen más lentamente y de una forma más asincrónica: 72 horas post-FIV, sólo un 27% de los embriones alcanzó el estadio de 8 células contra un 46% para los embriones in vivo (12). Por último, los embriones que sufren la segmentación más rápidamente tienen una capacidad de desarrollo superior en términos de formación de mórula-blastocisto, ya que el 35% de los EPIV alcanza este estadio 7 días tras la inseminación, mientras que la cifra se eleva a un 69% para el caso de los embriones in vivo.

Los Blastocisto

Un estudio comparado de la cronología del desarrollo embrionario in vitro de embriones madurados y fecundados in vivo evidenció diferencias morfológicas. Los embriones fecundados in vivo tienen, en la fase de una célula, un espacio perivitelino importante; en el estadio de 8 células, los blastómeros son de forma y tamaño regulares; las mórulas se compactan de forma sincrónica y las células de la MCI de los blastocistos están bien definidas. En el caso de EPIV, el espacio perivitelino en fase de 1 célula es muy limitado; en estadio de 8 células los blastómeros son irregulares en su forma y tamaño; la compactación de las mórulas es mucho menos pronunciada (en ocasiones no es apreciable), y las células de los blastocistos aparecen oscuras y difuminadas (11, 14).

Continuara...

Continuación

 Estas condiciones de cultivo, que permiten obtener los mejores porcentajes de embriones viables (hasta un 40% de blastocistos en día 7) inducen diferencias fundamentales tanto desde un punto de vista morfológico como fisiológico que deteminan que el comportamiento frente al frío de los EPIV sea diferente al de los embriones obtenidos in vivo.

Medio ambiente

El medio ambiente en el que se desarrolla el embrión in vitro difiere sustancialmente del que existe en condiciones in vivo. Durante su desarrollo in vitro los embriones se ven expuestos a choques térmicos, fuentes luminosas, atmósfera gaseosa (5% de CO2 en aire) y a unas condiciones de cultivo estáticas caracterizadas por una importante cantidad de medio rodeando al embrión que puede aportar un exceso, o bien carecer de los nutrientes necesarios.

Continuara...

El embrión bovino cultivado in vitro

 Tecnología In Vitro

Desde el inicio de la aplicación de la tecnología in vitro, se han desarrollado numerosos sistemas de cultivo capaces de llevar a buen término la producción de embriones bovinos. Estos sistemas se clasifican en función de su composición, o de la presencia o no de células en el medio de cultivo, como soporte del desarrollo embrionario. Las formulaciones de estos medios derivan de estudios realizados sobre la composición bioquímica de los medios tubárico y uterino, así como del análisis de las necesidades metabólicas del embrión.

Continuación

Dado que hasta la fecha, la mayor parte de los estudios sobre congelación se habían realizado a partir de embriones obtenidos in vivo, resultó patente en seguida, que los embriones producidos in vitro manifestaban un comportamiento diferente frente al frío, fenómeno que quedó corroborado por multitud de experimentos que se desarrollaron a partir de entonces.

La criopreservación exitosa

La criopreservación está influida por un elevado número de variables, de forma que ninguna aproximación que contemple sólo uno o parte de los aspectos implicados garantiza una eficacia total. A pesar de esto, y con independencia del sistema utilizado, los principios básicos persiguen una protección de las células frente a los principales efectos perjudiciales del proceso, a saber, formación de hielo intracelular, deshidratación y efectos tóxicos de los crioprotectores (4, 5, 25, 37).

El primer ternero resultado del trasplante de un embrión in vitro, congelado/descongelado nació en 1990 (10). Desde entonces han sido muchos los protocolos de congelación ensayados, pero su eficacia está corrientemente evaluada en términos de supervivencia tras descongelación y cultivo in vitro. Sólo unos pocos estudios ofrecen datos de porcentajes de gestación tras transferencia de uno o dos embriones en un número significativo de receptoras. Las tasas de gestación tras transferencia de embriones in vitro crioconservados por métodos clásicos de congelación lenta o por vitrificación son muy variables.

Estadísticas de los embriones transferidos

En el ámbito del ganado vacuno, y en el marco de la UE, las estadísticas correspondientes al año 1999 muestran que un 58% de los embriones transferidos estaban congelados (in vivo e in vitro), lo que da idea de la importancia del desarrollo de estas técnicas (1).

• La criopreservación y el almacenamiento de embriones a bajas temperaturas (Nitrógeno líquido-NL-) presenta numerosas ventajas, tanto desde el punto de vista biológico como desde el comercial:

• Permite una reducción de costes derivados de la aplicación de las tecnologías reproductivas.

• Facilita una disociación de todas estas técnicas de la actividad reproductiva cíclica que presentan las especies mamíferas de interés, consiguiéndose una independencia temporal del estado fisiológico de los animales (hembras receptoras, por ejemplo).

• Limita la deriva genética.

• Elimina las patologías que normalmente se asocian al mantenimiento de animales vivos.

La criopreservación

La criopreservación de los embriones supone el ralentizamiento de su metabolismo hasta un punto próximo a su detención, con el fin de sincronizar acontecimientos posteriores, o de modificar la ciclicidad reproductiva, y es una técnica ampliamente usada como complemento de los procesos de reproducción asistida.

Ricardo Fernandez Barrueco

Producción de embriones in vitro (EPIV)

La producción de embriones in vitro (EPIV) a partir de ovocitos obtenidos de vacas de alto mérito es una herramienta que ofrece nuevas perspectivas para la aceleración del progreso genético. Esta técnica se practica con ritmos de recogida intensivos (2 veces/semana durante 2 meses consecutivos) sobre hembras gestantes o vacías, e independientemente de su normalidad reproductiva. Asimismo, la FIV representa un medio para la producción de embriones a bajo precio a partir de ovarios de matadero. La utilización de las bajas temperaturas para conservar los embriones producidos por esta tecnología se ha convertido en una herramienta indispensable que permitirá consolidar y aumentar el impacto de estas tecnologías.

Continuaremos...

Éxitos en tecnológica In Vitro

Los primeros éxitos en la puesta a punto de la técnica de la fecundación in vitro (FIV), en un principio a partir de ovocitos madurados in vivo y obtenidos por lavado de los oviductos tras el sacrificio del animal, posteriormente con la utilización de ovocitos recuperados a partir de ovarios procedentes de matadero.

Por último, el desarrollo de un sistema que permite la obtención de ovocitos a partir de hembras vivas, conocido con el nombre de Ovum Pick-Up (OPU).

Tecnología in vitro Vacunos

Las posibilidades de aplicación de la tecnología in vitro son múltiples y presentan un elevado interés en el caso del ganado bovino. La tecnología reproductiva in vitro se encuentra actualmente en un estado de desarrollo avanzado.

El actual grado de desarrollo de la tecnología reproductiva in vitro ha sido posible gracias a tres hechos fundamentales:

La definición de medios sintéticos cada vez más adaptados a los requerimientos específicos para que el embrión bovino vea satisfechas sus necesidades metabólicas durante las primeras fases de su desarrollo.

RICARDO FERNANDEZ BARRUECO

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TESTS DE FUNCIONALIDAD ESPERMÁTICA BASADOS EN LA FIV

Se han diseñado numerosos tests para evaluar in vitro la funcionalidad de los espermatozoides, especialmente de dosis congeladas, en relación a su capacidad para interaccionar con el ovocito. Estos tests evalúan las distintas fases del proceso de fecundación, como la capacidad espermática de reconocimiento y unión a la zona pelúcida (ZP), la penetración de ovocitos homólogos o heterólogos (libres de zona pelúcida), o la inducción del desarrollo embrionario.

Continuara...

RICARDO FERNANDEZ BARRUECO

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TESTS DE UNIÓN A LA ZONA PELÚCIDA:

Este test se diseñó con el objetivo de cuantificar el número de espermatozoides capacitados que son capaces de unirse selectivamente ala zona pelúcida de ovocitos homólogos.

Los resultados de este test, en la especie humana, son altamente predictivos del resultado de la FIV . En algunas especies domésticas se ha intentado establecer una correlación entre los resultados del test de unión a la zona y la fertilidad in vivo del semen.

Continuara...

RICARDO FERNANDEZ BARRUECO

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TESTS DE PENETRACIÓN DE OVOCITOS DE HÁMSTER LIBRES DE ZONA PELÚCIDA:

Este test, desarrollado por Yanagimachi y Rogers (1976), permite valorar la capacidad de los espermatozoides para penetrar un ovocito de hámster libre de zona pelúcida. Se utiliza fundamentalmente en la especie humana para valorar la fertilidad espermática, debido a las restricciones legales o éticas que existen en algunos paí- ses para el uso de ovocitos humanos. Este test se ha desarrollado con éxito en la especie bovina (Brackett et al., 1982) pero su aplicación es muy escasa, puesto que es más sencillo obtener ovocitos bovinos a partir de ovarios de matadero que obtener ovocitos de hámster para luego extraerles la zona pelúcida.

RICARDO FERNANDEZ BARRUECO

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TESTS DE FIV:

La fecundación in vitro de ovocitos homólogos es, sin lugar a dudas, el test más completo para evaluar la funcionalidad espermática, ya que permite valorar todas las fases del proceso de fecundación, desde el estado de capacitación espermática hasta la fusión con la membrana vitelina del ovocito o el inicio del desarrollo embrionario (Lonergan, 1994; Shamsuddin et al., 1996; Ward et al., 2002). Aunque en algunos estudios se ha encontrado una elevada correlación con la fertilidad in vivo de los toros (Hillery et al., 1990; Marquant-Le Guienne et al., 1990; Zhang et al., 1997; Ward et al., 2003), todavía se necesita una mayor estandarización de los métodos a la hora de aplicar dicha técnica, puesto que existe considerable variabilidad entre los resultados de FIV obtenidos para un mismo toro, debido a factores de variación como por ejemplo el método de selección de los espermatozoides (percoll o swim-up) (Parrish et al., 1995), de capacitación espermática in vitro (Saeki et al., 1995) o el número de espermatozoides utilizado para la inseminación de los ovocitos 

RICARDO FERNANDEZ BARRUECO

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TÉCNICAS ACTUALES DE CONGELACIÓN DE EMBRIONES IN VITRO

Congelación tradicional (métodos de equilibrio)

Los crioprotectores (CP) utilizados en estos métodos son normalmente permeables. Los más frecuentemente utilizados son: glicerol y etilenglicol.

Durante la fase inicial de preenfriamiento, los embriones se exponen a la presencia del crioprotector en una fase que denominamos de equilibración. La respuesta inmediata del embrión ante la presencia de un CP permeable es una rápida disminución de volumen por pérdida del agua intracelular, hasta que se alcanza el equilibrio. Este fenómeno se debe a la hiperosmolaridad inicial de la solucion extracelular y a que los embriones son mucho más permeables al agua que a los crioprotectores; la contracción se detiene cuando se alcanza el equilibrio entre la salida de agua y la entrada del CP. A medida que el CP penetra en el embrión, éste se expande gradualmente a causa de una re-entrada de agua para el mantenimiento del equilibrio osmótico. El momento en que se produce esta re-expansión refleja:

• La especie del embrión.
  
  
• El estadio de desarrollo embrionario.
  
  
• El ratio superficie/volumen del embrión.
  
  
• El crioprotector utilizado.
  
  
• La temperatura de exposición.
  
  
  
  
  
  

  

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MEDIO AMBIENTE

El medio ambiente en el que se desarrolla el embrión in vitro difiere sustancialmente del que existe en condiciones in vivo. Durante su desarrollo in vitro los embriones se ven expuestos a choques térmicos, fuentes luminosas, atmósfera gaseosa (5% de CO2 en aire) y a unas condiciones de cultivo estáticas caracterizadas por una importante cantidad de medio rodeando al embrión que puede aportar un exceso, o bien carecer de los nutrientes necesarios (23). Estas condiciones de cultivo, que permiten obtener los mejores porcentajes de embriones viables (hasta un 40% de blastocistos en día 7) inducen diferencias fundamentales tanto desde un punto de vista morfológico como fisiológico que deteminan que el comportamiento frente al frío de los EPIV sea diferente al de los embriones obtenidos in vivo.

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EL EMBRIÓN BOVINO CULTIVADO IN VITRO

Desde el inicio de la aplicación de la tecnología in vitro, se han desarrollado numerosos sistemas de cultivo capaces de llevar a buen término la producción de embriones bovinos. Estos sistemas se clasifican en función de su composición, o de la presencia o no de células en el medio de cultivo, como soporte del desarrollo embrionario. Las formulaciones de estos medios derivan de estudios realizados sobre la composición bioquímica de los medios tubárico y uterino, así como del análisis de las necesidades metabólicas del embrión.

Vamos a ver cuáles son las diferencias que caracterizan a los EPIV y algunas de las alteraciones resultantes de las condiciones de cultivo in vitro. Algunos de estos parámetros deben ser tenidos en cuenta como indicadores de la capacidad de desarrollo de los embriones tras crioconservación y transferencia. Veremos también que las condiciones de cultivo afectan a las propiedades criobiológicas de las membranas celulares.

Continuara...

Ricardo Fernández Barrueco

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La criopreservación y el almacenamiento de embriones a bajas temperaturas (Nitrógeno líquido-NL-) presenta numerosas ventajas, tanto desde el punto de vista biológico como desde el comercial:

• Posibilita la conservación de razas o especies en riesgo de extinción mediante la creación de bancos de embriones congelados, manteniendo intacto el patrimonio genético.

• Permite una reducción de costes derivados de la aplicación de las tecnologías reproductivas.

• Facilita una disociación de todas estas técnicas de la actividad reproductiva cíclica que presentan las especies mamíferas de interés, consiguiéndose una independencia temporal del estado fisiológico de los animales (hembras receptoras, por ejemplo).

• Limita la deriva genética.

• Elimina las patologías que normalmente se asocian al mantenimiento de animales vivos.

Continuara..

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La producción de embriones in vitro (EPIV) a partir de ovocitos obtenidos de vacas de alto mérito es una herramienta que ofrece nuevas perspectivas para la aceleración del progreso genético.

 Esta técnica se practica con ritmos de recogida intensivos (2 veces/semana durante 2 meses consecutivos) sobre hembras gestantes o vacías, e independientemente de su normalidad reproductiva. Asimismo, la FIV representa un medio para la producción de embriones a bajo precio a partir de ovarios de matadero. 

La utilización de las bajas temperaturas para conservar los embriones producidos por esta tecnología se ha convertido en una herramienta indispensable que permitirá consolidar y aumentar el impacto de estas tecnologías.

La criopreservación de los embriones supone el ralentizamiento de su metabolismo hasta un punto próximo a su detención, con el fin de sincronizar acontecimientos posteriores, o de modificar la ciclicidad reproductiva, y es una técnica ampliamente usada como complemento de los procesos de reproducción asistida. En el ámbito del ganado vacuno, las estadísticas correspondientes al año 1999 muestran que un 58% de los embriones transferidos estaban congelados (in vivo e in vitro), lo que da idea de la importancia del desarrollo de estas técnicas

Continuara...

 Ricardo Fernández Barrueco

  

 TECNOLOGÍA IN VITRO 

Las posibilidades de aplicación de la tecnología in vitro son múltiples y presentan un elevado interés en el caso del ganado bovino. La tecnología reproductiva in vitro se encuentra actualmente en un estado de desarrollo avanzado.

El actual grado de desarrollo de la tecnología reproductiva in vitro ha sido posible gracias a tres hechos fundamentales:

•   La definición de medios sintéticos cada vez más adaptados a los requerimientos específicos para que el embrión bovino vea satisfechas sus necesidades metabólicas durante las primeras fases de su desarrollo.





•   Los primeros éxitos en la puesta a punto de la técnica de la fecundación in vitro (FIV), en un principio a partir de ovocitos madurados in vivo y obtenidos por lavado de los oviductos tras el sacrificio del animal, posteriormente con la utilización de ovocitos recuperados a partir de ovarios procedentes de matadero.





•   Por último, el desarrollo de un sistema que permite la obtención de ovocitos a partir de hembras vivas, conocido con el nombre de Ovum Pick-Up (OPU).












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Ricardo Fernández Barrueco


Análisis realizados

  Errores estándar de las variables MOT, PRO, []prog/ dosis, VCL, VSL, VAP, LIN, STR, ALH, BCF, DAP. Se probó si existían diferencias significativas entre los protocolos mediante la aplicación de análisis de la variancia a un criterio de clasificación y pruebas de comparaciones múltiples HSD de Turkey-Kramer. Se calcularon coeficientes de Pearson a los efectos de establecer relaciones entre las variables estudiadas. Todos los análisis estadísticos fueron realizados utilizando el programa JMP .

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ntegridad del acrosoma

Para la evaluación se colocó una gota de semen sobre un portaobjetos y al lado una gota similar de glutaraldehído al 0,2% diluido con buffer fosfato salino. Se realizaron tres lecturas por cada pajuela descongelada utilizando un microscopio de contraste de fase (1000X) y contando en cada extendido 100 espermatozoides. Para ello la muestra de semen se fijó con glutaraldehído al 2%. El defecto pudo ser la falta total del capuchón acrosómico o su pérdida en distintas proporciones. El resultado final se expresó en porcentaje e indica la proporción de acrosomas dañados (AD), no más del 50% de los espermatozoides debieron presentar acrosomas dañados para que la dosis sea considerada de calidad.


Continuara...

Ricardo Fernández Barrueco

Se incubó el semen durante 60 minutos en una solución hipoosmótica de fructosa y citrato de sodio a 100 mOsm/L en un baño María termoestable a 37°C. Para el análisis se realizaron tres lecturas por muestra descongelada observando 200 espermatozoides cada vez, y utilizando un microscopio óptico a 1000 aumentos. Los espermatozoides con cola enrollada totalmente, parcialmente, o simplemente acodada se consideraron vivos (reaccionados) y el resultado final se expresó porcentualmente (HOST). En cada muestra seminal debió observarse un mínimo de 40% de reaccionados para considerarla adecuada.


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Ricardo Fernández Barrueco

 

Motilidad, progresión y vigor de los espermatozoides

 

Se utilizó un sistema computarizado: Sperm Vision (Minitüb, Alemania), con cámara Leja de 2 µl y analizando 10 campos microscópicos. Este procedimiento se repitió tres veces por cada protocolo probado.

Los parámetros C.A.S.A. medidos fueron:

- Porcentaje de espermatozoides mótiles (MOT): porcentaje de células que tienen movimiento.

- % de espermatozoides progresivos (PRO): porcentaje de células que siendo mótiles, describen un desplazamiento hacia delante.
- Concentración de espermatozoides progresivos por dosis : expresada en millones.

- Velocidad curvolineal (VCL): velocidad calculada sobre el camino real del espermatozoide entre dos puntos de su trayectoria, expresada en micrones por segundo.

Ricardo Fernández Barrueco

Ricardo Fernández Barrueco

 

Evaluación de los cambios ocasionados en espermatozoides bovinos por variaciones en el manejo de dosis en manipulación de inseminación artificial

 

Materiales y métodos

Se utilizaron 162 muestras de semen de un toro Holando Argentino, de 1000 kg de peso, de fertilidad conocida y cuyos eyaculados fueran obtenidos por medio de vagina artificial. Luego de realizar la evaluación del semen en fresco (macroscópica y microscópicamente), las muestras clasificadas como aptas para congelar fueron procesadas y envasadas automáticamente en pajuelas de 0,5 cc utilizando un diluyente semidefinido: Andromed, Minitub Alemania y a una concentración espermática mínima de 30 millones de espermatozoides por dosis. Las dosis fueron congeladas y almacenadas en tanques de nitrógeno líquido a -196°C. El toro es propiedad de la Cooperativa de Inseminación Artificial de Venado Tuerto (CIAVT) y los procedimientos y análisis mencionados fueron realizados en dicho establecimiento con personal técnico del lugar.

CICLO ESTRAL

La vaca tiene un ciclo estral de 21 días aproximadamente durante el cual se suceden una serie de cambios fisiológicos, endocrinos, morfológicos y psíquicos en el animal (Hansel, 1959). 

Debido a que estos cambios ocurren en ciertos días específicos del ciclo, éste se ha dividido en períodos, designados como: estro, metaestro y proestro. Este ciclo puede ser interrumpido o prolongado por una preñez o una situación anormal.

Las hormonas que controlan el ciclo estral son producidas fundamentalmente por la glándula hipófisis y ovarios 

GENERALIDADES

Antes de comenzar un programa de transferencia de embriones es recomendable analizar una serie de detalles relacionados con el criadero en general y especialmente con las donantes y receptoras que se usarán. Por ejemplo el usar donantes subalimentadas o con problemas reproductivos, éstas no responderán en forma óptima al ser sometidas a grandes dosis degonadotrofinas (superovulación). Al igual receptoras de dudosa calidad reproductiva o sanitaria (muchas veces sucede que el criador compra hembras a terceros para usarlas como receptoras) disminuirán las posibilidades de obtener un alto porcentaje de preñez. También, un semen demala calidad dará como resultado una alta proporción de oocitos no fertilizados. Además de lo anteriormente mencionado, debe tenerse presente el equipo de colección y transferencia, las hormonas, esquema de tratamientos, etc.

SUPEROVULACIÓN

Haciendo tratamientos en base a grandes dosis de gonadotrofinas durante la fase luteal del ciclo se logra producir una maduración mayor de folículos que potencialmente darán origen a oocitos, esto se conoce como superovulación.

En transferencia de embriones se utiliza la superovulación para obtener mayor cantidad deoocitos, a partir de hembras genéticamente superiores y así, aumentar su capacidad reproductiva.

FOLICULOS Y OOCITOS

Los ovarios de una hembra bovina al nacer tienen aproximadamente 200 mil oocitos primarios que teóricamente al ser fertilizados pueden dar origen a un ser (Callesen y Greve, 1983).

Sin embargo, sólo un oocito es eliminado desde un folículo cada 21 días. Como se observa, los ovarios contienen 1.000 veces más oocitos que los que maduran y ovulan durante la vida productiva de un animal.

PROESTRO (día 18–20)

Es el período en que la hembra se prepara para ser cubierta. Los niveles de estrógeno aumentan rápidamente.

DIESTRO (día 5–17)

Se forma el cuerpo lúteo (CL) a partir del folículo que dio origen al oocito. La hormona predominante es la progesterona producida por el CL. Esta hormona prepara al útero para la futura anidación del embrión.

En el caso de no haber fertilización, el día 16 aproximadamente se producirá la regresión del CL, lo que traerá una baja en los niveles de progesterona, una alza en los niveles de FSH, la formación de un nuevo folículo, una alza de estrógeno, aumento de los niveles de LH y una nueva ovulación.

CONTINUARA...

METAESTRO (día 1–4)

Los niveles de estrógeno y progesterona son bajos y el útero se prepara para recibir el embrión.

CONTINARA...

ESTRO, CELO, CALOR (DÍA 0)

Tiene una duración aproximada de 24 horas y se caracteriza por presentar manifestaciones externas en la hembra que pueden ser fácilmente distinguidas (inquietud, mugidos, edematización y enrojecimiento vulvar, montan o se dejan montar por otros animales del rebaño, etc.). En los ovarios se desarrolla un folículo por la acción de la hormona folículo estimulante (FSH), este folículo alcanza un tamaño aproximado de 20–25 mm.

Ricardo Fernandez Barrueco

CONTINUARA...

EMBRIONAJE EN GANADO VACUNO

Para  la congelación de los embriones se empleó una  solución de 1.5 M  de  Etilenglicol, 0.4 % BSA y 0.1M  Sucrosa (Voelkel y Xu, 1995).  Los  embriones fueron expuestos en Etilenglicol durante 10 minutos y  envasadosen pajuelas  de  0.25 ml. Los embriones fueron colocados  en  la cámara de congelación a -6 °C durante 10minutos. La cristalización fue inducida  a los 2 minutos  seguido de una segunda fase de enfriamiento hasta –32°C (0.5 °C/min.) y final sumersión en nitrógeno líquido. 

RELACIÓN DE PRODUCCIÓN DE HUEVOS/EMBRIONES.

Hasta hace algunos años la colección y transferencia de embriones en bovinos se realizaba en forma quirúrgica por lo que se hacía muy difícil su aplicación en terreno (Rowson y col, 1969). El desarrollo de nuevos instrumentos, métodos de colección y colocación de los embriones en hembras receptoras, abrió la posibilidad de usarla como una técnica más en los programas reproductivos en animales de alto pedigree en los criaderos (Rowe y col, 1976; Eldsen y col, 1976, Rowe y col, 1980a).

Hoy, la técnica de transferencia de embriones, se practica en forma rutinaria en muchos países en el mundo. Es así como en U.S.A., solamente, en el año 1983 se transfirieron 71.637 embriones en forma comercial (Embryo Transfer Newsletter, 1984).