Continuación

A medida que el CP penetra en el embrión, éste se expande gradualmente a causa de una re-entrada de agua para el mantenimiento del equilibrio osmótico. El momento en que se produce esta re-expansión refleja:

• La especie del embrión.

• El estadio de desarrollo embrionario.

• El ratio superficie/volumen del embrión.

• El crioprotector utilizado.

• La temperatura de exposición.

Dentro de los sistemas de equilibrio (inicialmente diseñados para la congelación de embriones in vivo), la técnica más utilizada en el caso de los EPIV es la congelación en EG 1,5M en presencia de sacarosa. El equilibrio se alcanza a -7ºC (Tª de seeding) para después, realizar un descenso de la temperatura hasta los -32ºC a una velocidad de 0,3ºC/min.

Técnicas actuales de congelación de embriones in vitro

Congelación tradicional (métodos de equilibrio)

Los crioprotectores (CP) utilizados en estos métodos son normalmente permeables. Los más frecuentemente utilizados son: glicerol y etilenglicol.

Durante la fase inicial de preenfriamiento, los embriones se exponen a la presencia del crioprotector en una fase que denominamos de equilibración. La respuesta inmediata del embrión ante la presencia de un CP permeable es una rápida disminución de volumen por pérdida del agua intracelular, hasta que se alcanza el equilibrio. Este fenómeno se debe a la hiperosmolaridad inicial de la solucion extracelular y a que los embriones son mucho más permeables al agua que a los crioprotectores; la contracción se detiene cuando se alcanza el equilibrio entre la salida de agua y la entrada del CP. 

Las microgotas citoplasmáticas

Las microgotas citoplasmáticas de lípidos tienen una fuerte relación espacial con el retículo endoplásmico liso y desempeñan un papel muy importante como fuente de elementos nutritivos, pero también modificando las propiedades físicas y las funciones de las membranas. La presencia de estas microgotas podría tener, por si misma, un efecto directo sobre la supervivencia durante el enfriamiento.

El metabolismo embrionario

El metabolismo embrionario ha sido y es objeto de una gran cantidad de estudios, orientados a la elaboración de medios de cultivo que aporten al embrión todos aquellos sustratos necesarios para su adecuado desarrollo y no otros; el último fin sería la optimización de las técnicas de cultivo in vitro. Otra parte de los estudios está destinada a una profundización en el conocimiento de las diferencias entre ambos tipos de embriones, con el fin de poder responder a interrogantes como la diferente sensibilidad a la crioconservación.

La estructura mitocondrial

La estructura mitocondrial también difiere entre ambos tipos de embriones. Los EPIV ven reducida de forma significativa la relación volumen mitocondrial/volumen citoplasmático con relación a los embriones in vivo (9). Si tenemos en cuenta que este orgánulo es el lugar de la célula donde se asienta la mayor parte de las reacciones oxidativas responsables del suministro de energía y de los procesos de síntesis de ATP acoplados a dichas reacciones, cabe pensar que este hecho diferencial tenga también un reflejo a nivel metabólico.

Ultraestructura

La microscopía electrónica

La microscopía electrónica permite la observación de diferencias entre los embriones producidos in vivo en in vitro, en idénticos estadios de desarrollo, y entre EPIV en función del medio de cultivo. Los blastómeros de los EPIV tienen un número más elevado de vacuolas citoplasmáticas y fagosomas. Las uniones "gap" entre células son más cortas y menos numerosas. De una forma general, los embriones cultivados in vitro tienen un aspecto más oscuro y el citoplasma está sembrado de gran cantidad de inclusiones lipídicas, cuyo número varía en función de las condiciones de cultivo. Estas son muy numerosas cuando se suplementa el medio con suero, y son menos abundantes en el citoplasma de embriones cultivados en medios suplementados únicamente con BSA y aminoácidos.

Aberraciones Cromosómicas

La frecuencia de aberraciones cromosómicas varía entre un 2-17% en los embriones in vivo, para elevarse hasta un 45% en el caso de los EPIV, según el estadio de desarrollo; los factores que favorecen la aparición de estas alteraciones pueden tener un origen intrínseco (edad materna, calidad del ovocito...), pero principalmente tienen un origen extrínseco en el caso de la manipulación in vitro. En los bovinos las anomalías cromosómicas serían las responsables de parte de las mortalidades embrionarias precoces observadas en el momento de la implantación entre los días 21 y 35 tras la transferencia de EPIV. De hecho, las tasas de gestación medidas a día 21 por los niveles séricos de proteína específica de gestación, suelen ser más elevadas, para experimentar un descenso después del día 35.