RICARDO FERNANDEZ BARRUECO

Ricardo Fernandez Barrueco

MEDIO AMBIENTE

El medio ambiente en el que se desarrolla el embrión in vitro difiere sustancialmente del que existe en condiciones in vivo. Durante su desarrollo in vitro los embriones se ven expuestos a choques térmicos, fuentes luminosas, atmósfera gaseosa (5% de CO2 en aire) y a unas condiciones de cultivo estáticas caracterizadas por una importante cantidad de medio rodeando al embrión que puede aportar un exceso, o bien carecer de los nutrientes necesarios (23). Estas condiciones de cultivo, que permiten obtener los mejores porcentajes de embriones viables (hasta un 40% de blastocistos en día 7) inducen diferencias fundamentales tanto desde un punto de vista morfológico como fisiológico que deteminan que el comportamiento frente al frío de los EPIV sea diferente al de los embriones obtenidos in vivo.

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EL EMBRIÓN BOVINO CULTIVADO IN VITRO

Desde el inicio de la aplicación de la tecnología in vitro, se han desarrollado numerosos sistemas de cultivo capaces de llevar a buen término la producción de embriones bovinos. Estos sistemas se clasifican en función de su composición, o de la presencia o no de células en el medio de cultivo, como soporte del desarrollo embrionario. Las formulaciones de estos medios derivan de estudios realizados sobre la composición bioquímica de los medios tubárico y uterino, así como del análisis de las necesidades metabólicas del embrión.

Vamos a ver cuáles son las diferencias que caracterizan a los EPIV y algunas de las alteraciones resultantes de las condiciones de cultivo in vitro. Algunos de estos parámetros deben ser tenidos en cuenta como indicadores de la capacidad de desarrollo de los embriones tras crioconservación y transferencia. Veremos también que las condiciones de cultivo afectan a las propiedades criobiológicas de las membranas celulares.

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La criopreservación y el almacenamiento de embriones a bajas temperaturas (Nitrógeno líquido-NL-) presenta numerosas ventajas, tanto desde el punto de vista biológico como desde el comercial:

• Posibilita la conservación de razas o especies en riesgo de extinción mediante la creación de bancos de embriones congelados, manteniendo intacto el patrimonio genético.

• Permite una reducción de costes derivados de la aplicación de las tecnologías reproductivas.

• Facilita una disociación de todas estas técnicas de la actividad reproductiva cíclica que presentan las especies mamíferas de interés, consiguiéndose una independencia temporal del estado fisiológico de los animales (hembras receptoras, por ejemplo).

• Limita la deriva genética.

• Elimina las patologías que normalmente se asocian al mantenimiento de animales vivos.

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La producción de embriones in vitro (EPIV) a partir de ovocitos obtenidos de vacas de alto mérito es una herramienta que ofrece nuevas perspectivas para la aceleración del progreso genético.

 Esta técnica se practica con ritmos de recogida intensivos (2 veces/semana durante 2 meses consecutivos) sobre hembras gestantes o vacías, e independientemente de su normalidad reproductiva. Asimismo, la FIV representa un medio para la producción de embriones a bajo precio a partir de ovarios de matadero. 

La utilización de las bajas temperaturas para conservar los embriones producidos por esta tecnología se ha convertido en una herramienta indispensable que permitirá consolidar y aumentar el impacto de estas tecnologías.

La criopreservación de los embriones supone el ralentizamiento de su metabolismo hasta un punto próximo a su detención, con el fin de sincronizar acontecimientos posteriores, o de modificar la ciclicidad reproductiva, y es una técnica ampliamente usada como complemento de los procesos de reproducción asistida. En el ámbito del ganado vacuno, las estadísticas correspondientes al año 1999 muestran que un 58% de los embriones transferidos estaban congelados (in vivo e in vitro), lo que da idea de la importancia del desarrollo de estas técnicas

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 TECNOLOGÍA IN VITRO 

Las posibilidades de aplicación de la tecnología in vitro son múltiples y presentan un elevado interés en el caso del ganado bovino. La tecnología reproductiva in vitro se encuentra actualmente en un estado de desarrollo avanzado.

El actual grado de desarrollo de la tecnología reproductiva in vitro ha sido posible gracias a tres hechos fundamentales:

•   La definición de medios sintéticos cada vez más adaptados a los requerimientos específicos para que el embrión bovino vea satisfechas sus necesidades metabólicas durante las primeras fases de su desarrollo.





•   Los primeros éxitos en la puesta a punto de la técnica de la fecundación in vitro (FIV), en un principio a partir de ovocitos madurados in vivo y obtenidos por lavado de los oviductos tras el sacrificio del animal, posteriormente con la utilización de ovocitos recuperados a partir de ovarios procedentes de matadero.





•   Por último, el desarrollo de un sistema que permite la obtención de ovocitos a partir de hembras vivas, conocido con el nombre de Ovum Pick-Up (OPU).












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Análisis realizados

  Errores estándar de las variables MOT, PRO, []prog/ dosis, VCL, VSL, VAP, LIN, STR, ALH, BCF, DAP. Se probó si existían diferencias significativas entre los protocolos mediante la aplicación de análisis de la variancia a un criterio de clasificación y pruebas de comparaciones múltiples HSD de Turkey-Kramer. Se calcularon coeficientes de Pearson a los efectos de establecer relaciones entre las variables estudiadas. Todos los análisis estadísticos fueron realizados utilizando el programa JMP .

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ntegridad del acrosoma

Para la evaluación se colocó una gota de semen sobre un portaobjetos y al lado una gota similar de glutaraldehído al 0,2% diluido con buffer fosfato salino. Se realizaron tres lecturas por cada pajuela descongelada utilizando un microscopio de contraste de fase (1000X) y contando en cada extendido 100 espermatozoides. Para ello la muestra de semen se fijó con glutaraldehído al 2%. El defecto pudo ser la falta total del capuchón acrosómico o su pérdida en distintas proporciones. El resultado final se expresó en porcentaje e indica la proporción de acrosomas dañados (AD), no más del 50% de los espermatozoides debieron presentar acrosomas dañados para que la dosis sea considerada de calidad.


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Se incubó el semen durante 60 minutos en una solución hipoosmótica de fructosa y citrato de sodio a 100 mOsm/L en un baño María termoestable a 37°C. Para el análisis se realizaron tres lecturas por muestra descongelada observando 200 espermatozoides cada vez, y utilizando un microscopio óptico a 1000 aumentos. Los espermatozoides con cola enrollada totalmente, parcialmente, o simplemente acodada se consideraron vivos (reaccionados) y el resultado final se expresó porcentualmente (HOST). En cada muestra seminal debió observarse un mínimo de 40% de reaccionados para considerarla adecuada.


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Motilidad, progresión y vigor de los espermatozoides

 

Se utilizó un sistema computarizado: Sperm Vision (Minitüb, Alemania), con cámara Leja de 2 µl y analizando 10 campos microscópicos. Este procedimiento se repitió tres veces por cada protocolo probado.

Los parámetros C.A.S.A. medidos fueron:

- Porcentaje de espermatozoides mótiles (MOT): porcentaje de células que tienen movimiento.

- % de espermatozoides progresivos (PRO): porcentaje de células que siendo mótiles, describen un desplazamiento hacia delante.
- Concentración de espermatozoides progresivos por dosis : expresada en millones.

- Velocidad curvolineal (VCL): velocidad calculada sobre el camino real del espermatozoide entre dos puntos de su trayectoria, expresada en micrones por segundo.

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