Técnicas de coloración diferencial

Las técnicas de coloración diferencial existentes hoy en día permiten evidenciar más diferencias entre los embriones in vivo y los EPIV. Aunque embriones en el mismo estadio de desarrollo tengan un número comparable de células totales, la cantidad de células de la MCI es significativamente inferior en el caso de los EPIV (35). La evaluación conjunta del número total de células y del de la MCI es otro buen indicador de la calidad del embrión desarrollado en un sistema de producción determinado.

Ricardo Fernández barrueco

La viabilidad de los embriones cultivados

Embriones cultivados

La viabilidad de los embriones cultivados in vitro tras crioconservación está correlacionada con su cinética de desarrollo. Efectivamente, aquellos embriones que sufren su primera segmentación 26 a 36 h postFIV, alcanzan el estado blastocisto más rápidamente que los que se segmentan de forma más tardía (36-48 h). Estos blastocistos desarrollados tras 6-7 días de cultivo in vitro son menos sensibles a la congelación que los que necesitan ser cultivados durante más tiempo para alcanzar dicho estadio.

Divición asincrónica de los EPIV

Es más, los EPIV se dividen más lentamente y de una forma más asincrónica: 72 horas post-FIV, sólo un 27% de los embriones alcanzó el estadio de 8 células contra un 46% para los embriones in vivo (12). Por último, los embriones que sufren la segmentación más rápidamente tienen una capacidad de desarrollo superior en términos de formación de mórula-blastocisto, ya que el 35% de los EPIV alcanza este estadio 7 días tras la inseminación, mientras que la cifra se eleva a un 69% para el caso de los embriones in vivo.

Continuación

 Estas condiciones de cultivo, que permiten obtener los mejores porcentajes de embriones viables (hasta un 40% de blastocistos en día 7) inducen diferencias fundamentales tanto desde un punto de vista morfológico como fisiológico que deteminan que el comportamiento frente al frío de los EPIV sea diferente al de los embriones obtenidos in vivo.

El embrión bovino cultivado in vitro

 Tecnología In Vitro

Desde el inicio de la aplicación de la tecnología in vitro, se han desarrollado numerosos sistemas de cultivo capaces de llevar a buen término la producción de embriones bovinos. Estos sistemas se clasifican en función de su composición, o de la presencia o no de células en el medio de cultivo, como soporte del desarrollo embrionario. Las formulaciones de estos medios derivan de estudios realizados sobre la composición bioquímica de los medios tubárico y uterino, así como del análisis de las necesidades metabólicas del embrión.

Éxitos en tecnológica In Vitro

Los primeros éxitos en la puesta a punto de la técnica de la fecundación in vitro (FIV), en un principio a partir de ovocitos madurados in vivo y obtenidos por lavado de los oviductos tras el sacrificio del animal, posteriormente con la utilización de ovocitos recuperados a partir de ovarios procedentes de matadero.

Por último, el desarrollo de un sistema que permite la obtención de ovocitos a partir de hembras vivas, conocido con el nombre de Ovum Pick-Up (OPU).

RICARDO FERNANDEZ BARRUECO

RICARDO FERNANDEZ BARRUECO

TESTS DE FUNCIONALIDAD ESPERMÁTICA BASADOS EN LA FIV

Se han diseñado numerosos tests para evaluar in vitro la funcionalidad de los espermatozoides, especialmente de dosis congeladas, en relación a su capacidad para interaccionar con el ovocito. Estos tests evalúan las distintas fases del proceso de fecundación, como la capacidad espermática de reconocimiento y unión a la zona pelúcida (ZP), la penetración de ovocitos homólogos o heterólogos (libres de zona pelúcida), o la inducción del desarrollo embrionario.

Continuara...

RICARDO FERNANDEZ BARRUECO

Ricardo Fernández Barrueco

TESTS DE UNIÓN A LA ZONA PELÚCIDA:

Este test se diseñó con el objetivo de cuantificar el número de espermatozoides capacitados que son capaces de unirse selectivamente ala zona pelúcida de ovocitos homólogos.

Los resultados de este test, en la especie humana, son altamente predictivos del resultado de la FIV . En algunas especies domésticas se ha intentado establecer una correlación entre los resultados del test de unión a la zona y la fertilidad in vivo del semen.

Continuara...

RICARDO FERNANDEZ BARRUECO

RICARDO FERNANDEZ BARRUECO

TESTS DE PENETRACIÓN DE OVOCITOS DE HÁMSTER LIBRES DE ZONA PELÚCIDA:

Este test, desarrollado por Yanagimachi y Rogers (1976), permite valorar la capacidad de los espermatozoides para penetrar un ovocito de hámster libre de zona pelúcida. Se utiliza fundamentalmente en la especie humana para valorar la fertilidad espermática, debido a las restricciones legales o éticas que existen en algunos paí- ses para el uso de ovocitos humanos. Este test se ha desarrollado con éxito en la especie bovina (Brackett et al., 1982) pero su aplicación es muy escasa, puesto que es más sencillo obtener ovocitos bovinos a partir de ovarios de matadero que obtener ovocitos de hámster para luego extraerles la zona pelúcida.

RICARDO FERNANDEZ BARRUECO

RICARDO FERNANDEZ BARRUECO

TESTS DE FIV:

La fecundación in vitro de ovocitos homólogos es, sin lugar a dudas, el test más completo para evaluar la funcionalidad espermática, ya que permite valorar todas las fases del proceso de fecundación, desde el estado de capacitación espermática hasta la fusión con la membrana vitelina del ovocito o el inicio del desarrollo embrionario (Lonergan, 1994; Shamsuddin et al., 1996; Ward et al., 2002). Aunque en algunos estudios se ha encontrado una elevada correlación con la fertilidad in vivo de los toros (Hillery et al., 1990; Marquant-Le Guienne et al., 1990; Zhang et al., 1997; Ward et al., 2003), todavía se necesita una mayor estandarización de los métodos a la hora de aplicar dicha técnica, puesto que existe considerable variabilidad entre los resultados de FIV obtenidos para un mismo toro, debido a factores de variación como por ejemplo el método de selección de los espermatozoides (percoll o swim-up) (Parrish et al., 1995), de capacitación espermática in vitro (Saeki et al., 1995) o el número de espermatozoides utilizado para la inseminación de los ovocitos 

Ricardo Fernández Barrueco

Ricardo Fernández Barrueco

La producción de embriones in vitro (EPIV) a partir de ovocitos obtenidos de vacas de alto mérito es una herramienta que ofrece nuevas perspectivas para la aceleración del progreso genético.

 Esta técnica se practica con ritmos de recogida intensivos (2 veces/semana durante 2 meses consecutivos) sobre hembras gestantes o vacías, e independientemente de su normalidad reproductiva. Asimismo, la FIV representa un medio para la producción de embriones a bajo precio a partir de ovarios de matadero. 

La utilización de las bajas temperaturas para conservar los embriones producidos por esta tecnología se ha convertido en una herramienta indispensable que permitirá consolidar y aumentar el impacto de estas tecnologías.

La criopreservación de los embriones supone el ralentizamiento de su metabolismo hasta un punto próximo a su detención, con el fin de sincronizar acontecimientos posteriores, o de modificar la ciclicidad reproductiva, y es una técnica ampliamente usada como complemento de los procesos de reproducción asistida. En el ámbito del ganado vacuno, las estadísticas correspondientes al año 1999 muestran que un 58% de los embriones transferidos estaban congelados (in vivo e in vitro), lo que da idea de la importancia del desarrollo de estas técnicas

Continuara...

Ricardo Fernández Barrueco


Análisis realizados

  Errores estándar de las variables MOT, PRO, []prog/ dosis, VCL, VSL, VAP, LIN, STR, ALH, BCF, DAP. Se probó si existían diferencias significativas entre los protocolos mediante la aplicación de análisis de la variancia a un criterio de clasificación y pruebas de comparaciones múltiples HSD de Turkey-Kramer. Se calcularon coeficientes de Pearson a los efectos de establecer relaciones entre las variables estudiadas. Todos los análisis estadísticos fueron realizados utilizando el programa JMP .

Continuara...

Ricardo Fernández Barrueco

ntegridad del acrosoma

Para la evaluación se colocó una gota de semen sobre un portaobjetos y al lado una gota similar de glutaraldehído al 0,2% diluido con buffer fosfato salino. Se realizaron tres lecturas por cada pajuela descongelada utilizando un microscopio de contraste de fase (1000X) y contando en cada extendido 100 espermatozoides. Para ello la muestra de semen se fijó con glutaraldehído al 2%. El defecto pudo ser la falta total del capuchón acrosómico o su pérdida en distintas proporciones. El resultado final se expresó en porcentaje e indica la proporción de acrosomas dañados (AD), no más del 50% de los espermatozoides debieron presentar acrosomas dañados para que la dosis sea considerada de calidad.


Continuara...

Ricardo Fernández Barrueco

Se incubó el semen durante 60 minutos en una solución hipoosmótica de fructosa y citrato de sodio a 100 mOsm/L en un baño María termoestable a 37°C. Para el análisis se realizaron tres lecturas por muestra descongelada observando 200 espermatozoides cada vez, y utilizando un microscopio óptico a 1000 aumentos. Los espermatozoides con cola enrollada totalmente, parcialmente, o simplemente acodada se consideraron vivos (reaccionados) y el resultado final se expresó porcentualmente (HOST). En cada muestra seminal debió observarse un mínimo de 40% de reaccionados para considerarla adecuada.


Continuara...

Ricardo Fernández Barrueco

 

Motilidad, progresión y vigor de los espermatozoides

 

Se utilizó un sistema computarizado: Sperm Vision (Minitüb, Alemania), con cámara Leja de 2 µl y analizando 10 campos microscópicos. Este procedimiento se repitió tres veces por cada protocolo probado.

Los parámetros C.A.S.A. medidos fueron:

- Porcentaje de espermatozoides mótiles (MOT): porcentaje de células que tienen movimiento.

- % de espermatozoides progresivos (PRO): porcentaje de células que siendo mótiles, describen un desplazamiento hacia delante.
- Concentración de espermatozoides progresivos por dosis : expresada en millones.

- Velocidad curvolineal (VCL): velocidad calculada sobre el camino real del espermatozoide entre dos puntos de su trayectoria, expresada en micrones por segundo.

Ricardo Fernández Barrueco

Ricardo Fernández Barrueco

 

Evaluación de los cambios ocasionados en espermatozoides bovinos por variaciones en el manejo de dosis en manipulación de inseminación artificial

 

Materiales y métodos

Se utilizaron 162 muestras de semen de un toro Holando Argentino, de 1000 kg de peso, de fertilidad conocida y cuyos eyaculados fueran obtenidos por medio de vagina artificial. Luego de realizar la evaluación del semen en fresco (macroscópica y microscópicamente), las muestras clasificadas como aptas para congelar fueron procesadas y envasadas automáticamente en pajuelas de 0,5 cc utilizando un diluyente semidefinido: Andromed, Minitub Alemania y a una concentración espermática mínima de 30 millones de espermatozoides por dosis. Las dosis fueron congeladas y almacenadas en tanques de nitrógeno líquido a -196°C. El toro es propiedad de la Cooperativa de Inseminación Artificial de Venado Tuerto (CIAVT) y los procedimientos y análisis mencionados fueron realizados en dicho establecimiento con personal técnico del lugar.

CICLO ESTRAL

La vaca tiene un ciclo estral de 21 días aproximadamente durante el cual se suceden una serie de cambios fisiológicos, endocrinos, morfológicos y psíquicos en el animal (Hansel, 1959). 

Debido a que estos cambios ocurren en ciertos días específicos del ciclo, éste se ha dividido en períodos, designados como: estro, metaestro y proestro. Este ciclo puede ser interrumpido o prolongado por una preñez o una situación anormal.

Las hormonas que controlan el ciclo estral son producidas fundamentalmente por la glándula hipófisis y ovarios 

SUPEROVULACIÓN

Haciendo tratamientos en base a grandes dosis de gonadotrofinas durante la fase luteal del ciclo se logra producir una maduración mayor de folículos que potencialmente darán origen a oocitos, esto se conoce como superovulación.

En transferencia de embriones se utiliza la superovulación para obtener mayor cantidad deoocitos, a partir de hembras genéticamente superiores y así, aumentar su capacidad reproductiva.

FOLICULOS Y OOCITOS

Los ovarios de una hembra bovina al nacer tienen aproximadamente 200 mil oocitos primarios que teóricamente al ser fertilizados pueden dar origen a un ser (Callesen y Greve, 1983).

Sin embargo, sólo un oocito es eliminado desde un folículo cada 21 días. Como se observa, los ovarios contienen 1.000 veces más oocitos que los que maduran y ovulan durante la vida productiva de un animal.

PROESTRO (día 18–20)

Es el período en que la hembra se prepara para ser cubierta. Los niveles de estrógeno aumentan rápidamente.